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核酸提取是 NGS 样品制备方案的第一步。核酸是对所有已知生命形式都必不可少的大生物分子。它们由核苷酸组成，核苷酸是由三种成分组成的单体——糖、磷酸盐和含氮碱基。核酸的两大类是DNA和RNA。RNA 的糖是核糖，而 DNA 的糖是脱氧核糖。

显示RNA（左）和DNA（右）结构的图表。尿嘧啶是 RNA 中与腺嘌呤配对的碱基，而胸腺嘧啶与 DNA 中的腺嘌呤配对。图片来源：维基百科

核酸提取的方式

硫氰酸胍-苯酚-氯仿萃取

核酸的细胞结构被破坏后，使用 DNase 和 RNase 灭活细胞核酸酶。然后可以从细胞碎片中分离出所需的核酸。

单独的苯酚是一种易燃、腐蚀性和有毒的石碳酸。但是可以使用苯酚、氯仿和少量异戊基的混合物来提取 DNA。当向样品中加入苯酚和氯仿时，由于其亲水性，会形成一种乳液，在顶部含有一层 DNA。然后可以通过离心收集和沉淀 DNA。然后可以用无菌水溶解得到的 DNA 沉淀。

苯酚-氯仿提取步骤示意图：将苯酚-氯仿混合物加入细胞裂解液中，离心，然后用水洗涤得到分离的DNA。图片来源：伊娃·梅萨罗斯，2021

然后可以使用硫氰酸胍-苯酚-氯仿技术一步提取 RNA。使用由硫氰酸胍、乙酸钠、苯酚和氯仿组成的酸性溶液提取后，将 RNA 从 DNA 中分离出来。RNA 的回收是通过用异丙醇沉淀来完成的——这会产生一种酸性条件，使 RNA 保留在混合物的顶部。

氯化铯/溴化乙锭梯度离心

自 1950 年以来，研究实验室一直使用氯化铯/溴化乙锭梯度离心法。该方法利用铯离子和水之间的不同密度，以及溴化乙锭的嵌入来干扰 DNA 复制、转录、修复和重组。

与其他隔离方案相比，这种梯度离心是一种复杂、昂贵且耗时的方法。它需要大量样本，因此不适用于所有类型的测序。此外，溴化乙锭是有害的。因此，由于其局限性，该方法未在临床实验室中使用。

固相萃取

固相核酸纯化可以在当今市场上的大多数商业提取试剂盒中找到。它通常使用在离心力下操作的离心柱进行，从而可以快速有效地纯化 DNA。必须首先对色谱柱进行调节以吸收样品，这可以使用特定 pH 值的缓冲液来完成。细胞被破坏后，由于结合溶液的 pH 值，所需的核酸会被柱子吸收。然后通过用竞争剂洗涤去除污染物，并引入水以从柱中释放所需的核酸。

基于磁珠的纯化

磁分离现在被认为是一种用于纯化核酸的简单有效的方法。它是固相萃取的改进型。珠子具有负表面电荷并选择性地与蛋白质（例如 DNA）结合。有时可以通过将磁铁施加到管的侧面来辅助结合过程，因为这会聚集管壁附近的颗粒。然后可以倒掉样品的其余部分，包括细胞碎片和不需要的材料。使用缓冲液从磁性颗粒中去除核酸，并洗掉任何残留的污染物。